Microbiology

Chapter 1. Microbial Cell Structure and Function

Cell Envelope

Cytoplasmic Membrane 细胞膜

细菌

• 磷脂双分子层：
  • 细菌：乙醇胺head group, 甘油，脂肪酸尾（酯键ester连接）
  • 古菌：异戊二烯尾（醚键ether连接），有时候两层连成一个分子，形成双甘油四醚，亦有存在五元环的泉古菌醇，具有更强的耐热性
• 膜蛋白
• 刚性分子：细菌中常见的是藿烷类物质，真核生物中常见的是甾醇
  

（古菌磷脂双分子层）

• 细胞膜功能：渗透屏障、蛋白锚定、形成质子动力势（提供能量）

Transporting Nutrients into the Cell

三种机制：简单转运、ABC转运系统、基团转运

energy-driven (proton motive force, ATP, or another energy-rich compound)

Cell Wall

• 肽聚糖 Peptidoglycan（细菌细胞壁，古菌中没有）:
  • N-乙酰葡萄糖胺（G），N-乙酰胞壁酸（M），溶菌酶（lysozyme）可以切断两者连接的$\beta（1，4）$糖苷键，用于破除细胞壁
  • 氨基酸
  • DAP，二氨基庚二酸

• 革兰氏阳性菌：肽聚糖层更厚，特有磷壁酸，M上第三位DAP变为Lys，同时末端存在5个Gly，Lys与Gly连接形成肽桥，染成紫色，电镜照片表面较光滑
• 革兰氏阴性菌：肽聚糖层较薄，M上第三位为DAP，DAP与Ala连接，染成粉色，还存在外膜层，电镜照片表面粗糙

（革兰氏阳性菌）

（左：革兰氏阴性 右：革兰氏阳性）

• 青霉素的作用：和PBPs蛋白（Penicillin Binding Proteins）结合，而这种蛋白用于催化肽桥形成，这样就可以阻断转肽反应，阻止细胞壁形成。主要用于杀死革兰氏阳性菌
• 原生质体：去除细胞壁的微生物细胞

古菌

• 假肽聚糖Pseudomurein：
  • N-乙酰葡萄糖胺（G），N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸（T），以$\beta(1,3)$糖苷键连接，溶菌酶无效

LPS: Outer Membrane

• 细胞壁之外的另一层磷脂双分子层
• 只存在于革兰氏阴性菌中
• 包含磷脂多糖（LPS）和微孔蛋白（porins）
• 外膜与细胞膜之间是周质空间（periplasm），存在很多胞外蛋白

Cell Surface Structure And Inclusions

Cell Surface Structure

1. 荚膜Capsules and 粘液层Slime Layers：主要由多糖组成，粘稠，协助细胞粘在物体表面、抵抗细胞吞噬、抵抗干旱
2. 菌毛Fimbriae：和鞭毛相比较短，一种丝状的蛋白结构，帮助细菌吸附在物体表面也能帮助运动
3. Pili：丝状蛋白结构，比菌毛长，有些能帮助水平基因转移，Type IV pili帮助细菌蹭行运动（twitching motility）

Cell Inclusions

1. 内容颗粒：将一些物质聚合成不可溶颗粒储存在胞内，如Poly-b-hydroxybutyrate可作为碳源，Sulfur globules硫化细菌中存在
2. 磁小体：存在于趋磁细菌中，主要是一些铁氧化物
3. 气囊：在一些水体微生物中，表层是致密的蛋白，内部含有气体，帮助细菌漂浮在水面

Endospores 内生芽孢

• 能够抵抗极端环境，处在休眠状态，条件合适时可以复苏
• 只存在与一些革兰氏阳性菌中
• 芽孢内含有大量2，6-二吡啶羧酸，钙连接，抵抗脱水、稳定DNA
• 光学显微镜下具有折光性

Cell Locomotion

Flagella （细菌鞭毛）

• stator:定子
• flagellin:鞭毛蛋白
• 氢离子浓度梯度驱动，不是ATP
• 空心的

Archaella (古菌鞭毛)

• 比细菌鞭毛更小，类似与 type IV pili
• ATP水解驱动
• 运动较慢
• 实心的

Surface Motility

1. Twitching Motility: 用pili将自己拉过去，ATP驱动，Pseudomonas假单胞菌
2. Gliding Motility：沿着一个轴螺旋状前进，质子梯度势驱动，需要黏附蛋白，Myxococcus粘球菌

Chemotaxis 趋化性

• directed movement in response to chemical stimuli
• run and tumble
• 其他的趋向性：osmotaxis渗透压,hydrotaxis水,aerotaxis氧,phototaxis光

Eukaryotic Microbial Cells

Eukaryotic Cells

• 双层膜包裹的细胞核
• 其他细胞器：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、微丝微管
• 光合微生物中有叶绿体
• 有些具有运动性（真核鞭毛或纤毛cilia）
• 有些具有细胞壁（真菌和藻类）
• 细胞膜含有甾醇sterols,能够加强结构刚性

Nucleus and Cell Division

• 包含染色质：DNA缠绕在组蛋白histone上形成核小体nuluosome，然后再组织成染色质chromosome
• 古菌也包含组蛋白和核小体，与真核生物更接近
• 核仁nucleolus：核糖体RNA的合成
• 细胞分裂：
  • 有丝分裂mitosis
  • 减数分裂meiosis：二倍体diploid细胞转变为单倍体haploid细胞，结果产生4个单倍体配子gametes

Mitochondria and Chloroplasts

1. Mitochondria：在需氧真核微生物中进行氧化磷酸化，产生ATP，双层膜。内膜内陷形成嵴cristae，上面有很多电子传递链和ATP合成的酶。基质matrix中有三羧酸循环的酶。
2. Chloroplast：在光能自养真核细胞中进行光合成，内膜包围着基质，其中含有大量的Rubisco酶（卡尔文循环的关键酶，将二氧化碳转化为有机物）。内部还有膜堆叠形成的类囊体thylakoids，可以进行ATP合成。

Other Eukaryotic Cell Structures

1. 细胞骨架Cytoskeleton：
   • 微管microtubules：空心的，25nm，$\alpha , \beta$-tubulin，微管蛋白
   • 微丝microfilaments：7nm，actin聚合物
   • 中间丝intermediate filaments：纤维状角蛋白keratin
2. 内质网Endoplasmic Reticulum：粗面（脂质、碳水化合物合成）和光面（糖基化，膜材料合成）
3. 高尔基体Golgi complex：修饰内质网产物
4. 溶酶体Lysosomes: 含有大量消化酶，回收利用一些细胞部件

Chapter 2. Microbial Metabolism

Defining the Requirements for Life

Some Concepts

• Catabolism ： to obtain energy 分解代谢
• Anabolism： to make cellular material 合成代谢

Fundamental metabolism requirements

• 水、碳源、其他营养物质
• 自由能free energy：可以用来做功的能量

          $\Delta G^0$定义在ph=7, 25摄氏度, 1AOP, 1M
          Exergonic 放能的：$\Delta G^0 < 0$ 
          Endergonic 吸能的：$\Delta G^0 > 0$ 
  

• 还原力reducing power: 电子的来源(redox reaction)

                      Electron donor: be oxidized
          Electron acceptor: be reduced
  

Metabolism Classes

1. Phototrophs:光能营养
   • oxygenic photosynthesis: 能产生氧气
   • anaxygenic photosynthesis：不产生氧气
2. Chemotrophy: 化能营养
   • Chemoorganotrophs: 有机营养型，利用有机物(葡萄糖，有机酸等)
   • Chemolithotrophs：无机营养，利用无机物（$H_2,H_2S$等）
   • aerobic reaction：需要氧气作为电子受体
   • anaerobic reaction: 不需要氧气，用其他物质作为电子受体
3. Heterotrophs: 异养型
4. Autotrophs: 自养型，也叫初级生产者（primart producers）

Electron Transfer Reactions

Redox Tower

Reduction potential: affinity of substance for electrons, 用氧化还原电位$E_0’$表示，数值越大和电子的亲和力越强

Electron Carriers

• 电子不能在溶液中自由移动，必须要电子载体
• $NAD^+/NADH$:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，可以转移两个电子，常见于分解代谢
• $NADP^+/NADPH$：常见于合成代谢

Calculating Changes in Free Energy

$$\Delta G^o = -nF\Delta E_0'$$ $$\Delta G^o = G_f^o(products) - G_f^o(reactants)$$

Under actual conditions:

$$\Delta G = \Delta G^o + RT\ln K_{eq}$$

Cellular Energy Conservation

Energy-Rich Compouds

• PEP: phosphenolpyruvate
• ATP: Adenosine triphosphate
• Glucose 6-phosphate
• Acetyl-CoA
• Acetyl phosphate: 磷酸基乙酰

Mechanisms of Energy Conservation

• Substrate-level phosphorylation:底物水平磷酸化，高能键水解产能
• Oxidative phosphorylation:氧化磷酸化，利用电化学梯度的能量
• Photophosphorylation:光合磷酸化，利用光能产生电化学梯度

Catalysis and Enzymes

• Activation energy：活化能，让化学反应开始所需的最小能量
• Enzymes: Catalysts lower activation energy, increasing reaction rate.辅基（Prosthetic groups）：紧密的共价连接。辅酶（Coenzyme）：非共价作用松散连接。

Respiration

• defination: electrons transferred from reduced electron donors to external electron acceptors
• Arranged with increasingly more positive reduction potential
• 电子传递链中的电子载体：$FAD/FADH_2$单黄素核苷酸，Quinones醌，Cytochromes细胞色素（包含血红素中心的蛋白），CoQ辅酶Q
• Can generate a proton motive force(PMF)

Chapter 3. Microbial Growth and Its Control

Culturing Microbes and Measuring Their Growth

Cell Nutrition

• macronutrients: 大量营养物质
• micronutrients: 微量金属元素（铜、锌、锰等，是许多酶的辅因子）、生长因子（一些化合物的合成前体、维生素、生化反应的辅酶）

Growth Media

• 培养基：defined media成分明确的，complex media成分复杂，selective medium选择培养基，differential medium区分培养基

Microscopic Counts

• 细胞计数板：死细胞也会被计入，细菌看不到
• 活细胞计数：梯度稀释，计数CFU（colony forming unit）;流式细胞术，检测有荧光标记的细胞；吸光度法

Dynamics of Microbial Growth

Binary Fission and Growth Cycle

• 细胞一分为二
• septum:分裂环，partition between dividing cells, pinches off between two daughter cells
• generation time:细胞一分为二所需的时间(g=t/n,t为指数生长时间，n为代史数量)
• 在封闭系统中培养的growth curve: lag phase滞留期, log phase对数生长期, stationary phase稳定期，death phase死亡期

Continuous Culture

• Chemostat：恒化器，一边输入培养基，一边输出培养基,可以模拟微生物一直旺盛生长的环境
• 可以控制恒定的生长率和产物产量
• Dilution rate(D): F/V

Biofilm Growth

• sessile growth: 固着生长，可以形成生物膜
• 形成的阶段：planktonic cells attach浮游细胞黏附，colonization生长并分泌多糖,development代谢发生改变适合固着生长，dispersal传播
• microbial mats：微生物菌垫，每层都是不同的微生物，形成很多层叠在一起

Environmental Effects on Growth

Temperature

嗜冷菌、嗜温菌、嗜热菌、超嗜热球菌

• 嗜冷菌：0-20摄氏度，最适温度一般低于15摄氏度，蛋白有更多的$\alpha$螺旋，更多的极性分子，更少的疏水性，膜多不饱和脂肪酸，多胞外多糖
• 嗜热菌：生活在65摄氏度以上的环境中的菌一般都是原核的细菌和古菌

Osmolarity

抗渗透压保护剂：甘油、四氢嘧啶、甘氨酸甜菜碱等

Oxygen

• aerobes: 专性好氧
• microaerophiles：微好氧
• facultative：兼性好氧
• resazurin刃天青染色可以指示培养基中的氧气浓度
• 氧气毒性：氧气会产生很多毒性产物，如超氧阴离子，过氧化氢，氧自由基
• 好氧微生物抵抗毒性氧的反应：

Growth Control

• 10倍致死时间：存活率从100%降到10%的时间
• MIC ： minimu inhibitoty concentration 最低抑制浓度

Chapter 4. Viruses

What is a virus ?

• 营寄生，只有通过感染宿主细胞才能复制增殖
• virulent virus: 进入lytic pathway 裂解，大量复制后摧毁宿主细胞
• temperate virus：进入lysogenic pathway融源，将遗传物质整合进宿主细胞的基因组
• 核酸的类型：DAN病毒：ssDNA, dsDNA；RNA病毒(逆转录) ：ssRNA, dsRNA
• 基因组大小：从最小的圆环病毒1.75kb到潘多拉病毒2.5Mb都有，RNA病毒的基因组一般比DNA病毒要小

Sructure of Viruses

1. Helical symmetry: 螺旋，形成长棍，壳粒包裹核酸，如烟草花叶病毒
2. Icosahedral symmetry: 球状，如人乳头瘤病毒
3. bacteriophages：头head、领collar、尾tail、尾针tail pins、底盘base plate、尾纤维tail fibers
4. enveloped viruses: 存在更多复杂的结构如刺突蛋白spike、脂质膜、膜蛋白、维蛋白（头发状多聚物，用于黏附宿主）、顶端孔apical pore和星门stargate（用于释放基因组）

• 病毒颗粒内的酶：溶菌酶（用于打开宿主细胞注入基因组或释放新的病毒），神经氨酸酶（破坏糖蛋白、糖脂，常见于流感病毒），核酸聚合酶（RNA复制酶 ，逆转录酶等）

Culturing, Detecting,and Counting Viruses

• Tilter: 滴度，单位体积内的感染单位
• plaque assay：空斑测试法，计量plaque forming unit（PFU）
• 病毒需要与活细胞共培养

Virulent Life Cycle （T4噬菌体）

• 生长曲线：侵入期+成熟期

• 侵染需要和宿主细胞表面的受体蛋白识别，在进行病毒复制的宿主细胞成为感受态细胞permissive cell

• T4 噬菌体的侵染penetration：尾纤维和脂多糖结合，尾针接触细胞壁，溶菌酶钻孔，尾针插入细胞，注射DNA，外壳留在细菌外

• T4 噬菌体基因组的复制replication：

• T4 噬菌体的组装assemble：需要一个packaging motot complex，消耗ATP将dsDNA塞进头部

Lysogeny Life Cycle （$\lambda$ 噬菌体）

• 整合：
• 滚环复制：

Defense Mechanism

1. 细菌：

   • CRISPR :类似于RNA干扰
   • Restriction modification system: 限制性内切酶切割外源双链DNA

2. 病毒：

   • DNA化学修饰：甲基化、糖基化
   • 产生抑制限制性内切酶系统的蛋白

Eukaryotes Viruses

动物病毒

• 与原核病毒的区别：整个病毒进入宿主细胞，在细胞核内复制，有些细胞会形成病毒质体来加速病毒组装并抵抗宿主的防御机制
• 通常会有一个由宿主细胞膜构成的envolope
• 导致的结果：烈性感染，导致宿主裂解；潜伏感染，将基因组整合进宿主基因组，条件合适后开始复制；持续感染，缓慢释放，不会裂解宿主细胞；转化感染，可能使宿主细胞转化为癌细胞

植物病毒

• 通常通过昆虫传播
• 在植物内通过胞间连丝扩散

Virus Classification

Viriod (类病毒)

• 裸露的单链RNA，没有蛋白质颗粒，非常短（246-399bp）
• 单链RNA形成环状发卡结构，使其在体外较为稳定
• 只在植物中发现

Prions（朊病毒）

• 感染性蛋白颗粒
• 可以催化蛋白质构象改变，从而聚集沉淀，引起疾病
• 在动物中发现
• 致病机制：传染性致病，病原体感染；随机性致病，随机发生的蛋白质错误折叠；遗传性致病，Prnp基因突变

Chapter 6. Molecular Information Flow and Protein Processing

Fundamental Knowledge of Molecular Biology

• Gene
• Codon
• Operon操纵子：A DNA fragment transcribed into a single mRNA molecule, may contain more than one gene

• Bacterial rRNA transcript containing introns内含子

• Double Helix: Antiparallel, $A=T,C\equiv G$, Minor/Major Groove（大沟小沟，大沟是DNA-蛋白质作用的位点），最常见的B型DNA10bp=3.4nm

• DNA可以形成supercoiling超螺旋，来进一步折叠，在DNA gyrase的作用下形成负超螺旋，一些抗生素（氟喹诺酮环丙沙星、新霉素）作用于该酶

• Chromosome or Plasmid: Chromosome has house-keeping gene or essential genes but plasmid not.

• Transposable Elements: Insertion sequences插入序列，transposons转座子

• 质粒的特性：Incompatible——同一类型的两个不能共存，Episomes——可以被整合进染色体，Curing ——可能会因为连续传代或化学诱导丢失，Conjugation——可能可以进行基因水平转移

DNA Replication

Semiconservative Replication

• Meselson-Stahl Experiment： $N^{15},N^{14}$同位素标记，有轻带和重带
• 延伸方向：$5’\rightarrow 3’$
• 需要DNA解旋酶、DNA聚合酶和RNA primer(菌体自己用的RNA，体外分子生物学实验可以用DNA primer),原料是dNTP

• Leading strand、Lagging strand(含有Okazaki fragment)

• Lagging strand的合成过程

• Bidirectional Replication：双向复制，形成$\theta$结构

• DNA复制复合体：

Transcription

In Bacteria

1. tRNA:转运RNA，平面有loop结构，有很多稀有核苷酸，含有反密码子，3’长臂有CCA尾，能携带氨基酸
2. rRNA:核糖体RNA，具有可变区和不可变区，是鉴定菌种的重要序列
3. mRNA:信使RNA，非常容易被分解，较短的半衰期

• RNA聚合酶：$\beta,\beta ‘,2\alpha,\omega,\sigma$，其中$\sigma$因子识别启动子promoter区域并招募剩下的因子结合后离开，剩下的五个亚基称为core enzyme。不同的$\sigma$因子识别不同的启动子
• Termination：转录终止，RNA会形成一个stem-loop茎环结构，然后阻止继续转录，可以是依赖Rho因子的，也可以不依赖。

Translation

• 氨酰基-tRNA合成酶，将氨基酸转移到tRNA上

• tRNA上的反密码子和mRNA上的密码子配对，第三位一般是简并的（degenerate），但是不同物种中有一定的偏好性。

• 起始密码子AUG,GUG，细菌中通常是N-甲酰甲硫氨酸；终止密码子（一般是nonsense的）UAA,UAG,UGA

• 开放阅读框Open Reading Frames(ORF)

• 核糖体：30S: 16S rRNA + 21 proteins; 50S: 5S + 23S + 31 proteins; 具有EPA三个位点

• 翻译过程：

• 原核生物可以转录翻译同时进行，且一条mRNA上可以结合多个核糖体同时翻译

• Release factor:识别终止密码子，将肽链从最后一个tRNA上切下来并使核糖体脱离
• tmRNA:可以拯救因终止密码子缺失而无法脱离的核糖体，作用是给错误的mRNA加一个终止密码子

Protein Processing, Secretion and Targeting

Protein Processign

• 折叠需要一些分子伴侣的协助

Secretion

• sec system: 当蛋白需要被分泌到胞外或膜上时，需要带上一段信号肽，帮助跨膜运输，出去之后会被切掉以发挥正常功能。转运没有折叠的肽链

• tat system: 双精氨酸转运酶。转运折叠好的蛋白质。

Chapter 7. Microbial Regulatory Systems

DNA-Binding Proteins and Transcriptional Regulation

DNA-Binding Proteins

• 特异性的：regulators 非特异性的：组蛋白、单链结合蛋白SSB
• 一般是两个亚基，非共价结合在两个相邻的大沟里
• 结果：RNA聚合酶、激活或抑制基因

Negative Control

Repression

• example——arg operator：repressor抑制蛋白一开始不结合操纵子，corepressor（Arg）使抑制蛋白变构并发挥抑制功能

Induction

• example——lac operator: repressor抑制蛋白一开始就结合在操纵子上，inducer（IPTG）使抑制蛋白变构脱离DNA并激活转录

Positive Control: Activation

• example——mal operon, 一般是弱启动子，需要inducer来激活activator，从而激活下游转录

Global Control

• Global control systems: regulate expression of many different genes simultaneously
• Catabolite Repression(glucose effect): Preferred substrate used first,在同时有葡萄糖和乳糖的培养基中，先利用葡萄糖，再利用乳糖
• 作用过程：当葡萄糖存在时，抑制cAMP合成并将已有的cAMP泵出细胞。cAMP的效应蛋白是CRP，一种activator。所以当葡萄糖充足的时候，CRP不会结合DNA

Sensing and Signal Transduction

Two-Component System

• sensor感受外界信号，自磷酸化，再磷酸化调控蛋白，调控蛋白结合DNA

Quorum Sensing 群体感应

• 只有群体数量达到一定数量时，才能产生某种效应。比如发光弧菌细胞数量达到一定数量后，才能产生荧光素酶发出荧光；一些病原菌达到一定数量后，才会产生毒素。
• 群体效应物：革兰氏阴性菌通常是酰基高丝氨酸内酯（AHL）；革兰氏阳性菌中通常是短肽
• example——大肠杆菌产生志贺氏毒素

The Stringent Response

• In reaction to amino acid or carbon starvation
• 营养短缺时，会有大量空载的tRNA, 结合到核糖体上会激活RelA，RelA会合成pppGpp, pppGpp再由SpoT合成ppGpp物质，启动Stringent Response

RNA-Based Regulation

Regulatory RNAs

• sRNA: smallRNA和mRNA的RBS结合，阻止翻译；或与5‘UTR结合，防止在RBS形成回环结构；或与RNA酶的结合位点结合，阻止mRNA降解
• Hfq蛋白：伴侣蛋白，帮助sRNA和mRNA之间的结合

Riboswitches 核糖开关

• a part of an mRNA molecule that can directly bind a small target molecule, and whose binding of the target affects the gene’s activity
• 形成茎环结构阻止翻译启动或提前终止翻译

Attenuation 衰减作用

• Leading sequence: 合成某种氨基酸的基因前方有一段先导序列，富含该种特定氨基酸，如trp合成基因的先导序列富含trp，用于检测是否是要进行后续的转录
• trp丰富的时候，先导链上的trp位置合成无障碍，整个先导链一直合成，直到遇到先导链末端的茎环结构，该茎环结构指示转录终止，后面的trp合成基因也不会继续转录。
• 
• trp缺乏的时候，遇到先导链的trp位置就无法继续，导致2，3部分形成一个替代的茎环结构，这不是转录终止的信号，会让聚合酶继续转录出后续的trp合成酶。
• 

Chapter 9. Genetics of Bacteria and Archaea

Mutations

Some concepts

• mutation: 突变
• mutant：突变体
• genotype: 基因型
• phenotype: 表型
• auxotroph： 营养缺陷型
• missense mutation：一个氨基酸突变成另一个氨基酸
• nonsense mutation: 终止密码子提前出现
• silent mutation: 碱基突变不改变氨基酸类型
• frameshift：开放阅读框移码（由insertion或deletion引起）
• reversion：回复突变，突变体经过第二次突变，完全或部分恢复为原来的基因型和表现型
• suppressor：回复突变中另一个突变发生的地方，一般使tRNA

Induced mutations

• 类似物（analog）诱变：5-溴-尿嘧啶可以替换T，其本身将与C配对，从而将AT诱变为GC
• 插入剂（Intercalating agents) 诱变： Ethidium bromide，造成读码框位移
• 辐射诱变(radiation)：形成pyrimidine dimers，造成DNA损伤

Repair systems

• Error-free：先切除损伤的单链，再重新合成
• Error-prone: dsDNA recombination mechanism——SOS system（DNA polymerase IV, V）

Gene Transfer in Bacteria

Genetic Recombination

Transformation（转化）

• Host cells must be competent（感受态）

• In some bacteria,competence directly linked to pili

Transduction （转导）

• DNA transfer mediated by a virus.
• Generalized: any portion of the host genome
• Specialized: DNA from a specific region of the host genome.

Conjugation （接合）

• 基因转移通过pili介导的细胞-细胞接触
• 基因滚环复制
• F plasmid, 核心蛋白TraI（一种解旋酶，引起滚环复制）

• Hfr conjugation: High frequency of recombination,通过同源重组的方式将F质粒转移到受体细胞的染色体基因组上。由于具有复制起点，可以在基因组上进行滚环复制。
• Hfr + $F^-$ 还是Hfr + $F^-$ ，不会产生新的$F^+$，如下图右，复制起点不会把tra也复制过去。